TÉCNICA PARA COLORAÇÃO DE GRAM

A técnica de coloração de Gram é uma técnica de coloração diferencial que permite distinguir os dois principais grupos de bactérias por microscopia óptica.  Foi descoberta pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Este cientista obteve  com a coloração realizada uma melhor visualização das bactérias em amostras de material  infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este método o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse  reconhecida a devida importância ao seu método de coloração. Actualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

A técnica de coloração de Gram consiste em expor as células bacterianas à seguinte sequência:

Corante primário – violeta de cristal: cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula. Mordente – solução de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel dentro da célula.       Agente descolorante – álcool, acetona ou ambos: solvente lipídico.        Contrastante – safranina ou fucsina básica: cora o citoplasma de vermelho.

                     O que se verifica, quando se observam as diferentes bactérias sujeitas a esta coloração ao microscópio, é que estas têm um comportamento diferente face à coloração de Gram, o que permite classificá-las em:

	Bactérias Gram-positivo   (apresentam cor púrpura)		Bactérias Gram-negativo       (apresentam cor vermelha)

  

                Estudos de microscopia electrónica e análises bioquímicas permitiram concluir que a parede  celular bacteriana é a estrutura responsável pelo diferente comportamento das bactérias à coloração de Gram.

As bactérias Gram-positivoapresentam uma parede espessa, homogénea, geralmente não estratificada e predominantemente constituída por peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolúvel que se forma por acção do mordente, fica retido no interior da célula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas células não são descoradas permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário (púrpura).

As bactérias Gram-negativo apresentam uma parede estratificada constituída por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contém peptidoglicano e que é mais fina que a das Gram-positivo. Deste modo, o precipitado insolúvel, que se forma por acção do mordente, é removido (camada de peptidoglicano é mais fina que a das Gram-positivo e a membrana externa é parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as células ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante.

Desta forma, a diferente estrutura da parede bacteriana e, em particular a espessura da camada de peptidoglicano, é a responsável pelo diferente comportamento das bactérias face à coloração de Gram.

O peptidoglicano é um heteropolímero rígido e insolúvel na água, constituído por cadeias lineares de dois açúcares aminados – NAG (ácido n-acetilglucosamina) e NAM (ácido n-acetilmurâmico) – ligados entre si por ligações glicosídicas. As cadeias lineares ligam-se entre si através de cadeias de quatro aminoácidos